Trang chủ Bằng phát minh, sáng chế • Liên hệ     • Giới thiệu     • Tài liệu hướng dẫn

Quy trình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và sinh phẩm huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất

Cập nhật Thứ ba - 12/01/2016 14:28 In bài viết

1. Tên sáng chế, phát minh, giải pháp:
Quy trình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và sinh phẩm huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất
2. Số bằng,ký hiệu: 1-0003638
3. Thuộc lĩnh vực KH&CN Công nghệ sinh học (Sáng chế)
4. Ngày công bố 25/08/2003
5. Ngày cấp 25/08/2003
6. Chủ sở hữu chính Trường đại học y dược thành phố Hồ Chí Minh
7. Tác giả Trịnh Xuân Kiểm Trịnh Kim ảnh Lê Khắc Quyến Nguyễn Bá Phước Phạm Mạnh Hùng
8. Điểm nổi bật
Sáng chế đề xuất quy trình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất (Naja Kaouthia antivenom) của Việt Nam bao gồm các công đoạn khử độc nọc rắn hổ đất bằng gluteraldehyt, miễn dịch ngựa theo liều gây chết hoàn toàn (CLD), tách plasma ngựa và tinh chế hai giai đoạn bằng pepsin và dung dịch (NH4)SO4 để tạo huyết thanh kháng nọc rắn. Ngoài ra, sáng chế còn đề cập đến sinh phẩm huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất bao gồm huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất được sản xuất theo quy trình nêu trên.
9. Mô tả về sáng chế, phát minh, giải pháp
Lĩnh vực kỹ thuật được đề cập
Sáng chế thuộc lĩnh vực miễn dịch học, cụ thể là đề cập đến quy trình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và sinh phẩm huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất.
Tình trạng kỹ thuật của sáng chế
Trên thế giới có nhiều loài rắn khác nhau, mang tính đặc trưng cho từng vùng địa lý. Do nọc rắn khác nhau nên có nhiều kỹ thuật sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn khác nhau, như phương pháp sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn bằng nhiệt, hóa chất, v.v. phù hợp với nọc rắn của từng loại rắn của từng địa phương hoặc quốc gia như úc, Pháp. Phương pháp đã biết bao gồm các công đoạn khử độc của nọc rắn bằng nhiệt ở 90°c trong 10 phút, miễn dịch cừu, thu hồi huyết thanh, tạo huyết thanh kháng nọc rắn với protein toàn phần, không đặc hiệu.
Nhược điểm của phương pháp này là chỉ tạo ra huyết thanh kháng nọc rắn thường là IgG toàn phần, nên hiệu lực kém, gây nhiều tác dụng phụ. ngoài ra, loại huyết thanh kháng nọc rắn này không đặc hiệu đối với rắn độc Việt Nam, nên không sử dụng được để chữa cho người và động vật khi bị rắn độc Việt Nam cắn.
Bản chất kỹ thuật của sáng chế
Mục đích của sáng chế là để xuất quy trình sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất (Naja Kaouthia antivenom) của Việt Nam. Quy trình này bao gồm các công đoạn khử độc nọc rắn hổ đất bằng gluteraldehyt, miễn dịch ngựa theo liều gây chết hoàn toàn (Complete Lethal Dose - CLD), tách plasma ngựa và tinh chế hai giai đoạn bằng pepsin và dung dịch (NH4)2SO4 để tạo ra huyết thanh kháng nọc rắn.
Công đoạn khử nọc rắn hổ đất được tiến hành như sau:
Đầu tiên, nọc rắn hổ đất đông khô được pha loãng bằng dung dịch PBS (Phosphat Buffer Saline - muối đệm phosphát) theo tỷ lệ giữa nọc rắn đông khô và PBS là 1-1,5% sao cho giá trị CLD-100% chuột là 7μg/l con chuột, nặng
20g. Sau đó, dung dịch nọc rắn thu được được khử độc bằng cách cho từ từ dung dịch gluteraldehyt vào theo tỷ lệ 0,25%. Quá trình khử độc được tiến hành ở nhiệt độ 37°c, độ pH=7,3. Độ pH được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH đậm đặc. Theo dõi và chỉnh độ pH trong một tuần đến khi độ pH ổn định, có nghĩa là lúc đó dung dịch đã được khử độc tố (dung dịch kháng nguyên).
Công đoạn miễn dịch ngựa được thực hiện như sau:
Đầu tiên, cần chọn ngựa đực khỏe, non dưới ba năm tuổi là những con ngựa có khả năng miễn dịch cao, sau đó tiêm dung dịch kháng nguyên vào ngựa theo liều lượng tăng dần (từ 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 1,0; 1,2;...) phối hợp cùng tá dược CFA (Comlete Freund Ajuvant), IFA (Incomplete Freund Ajuvant) theo tỷ lệ 1/2 thể tích, nhịp nhàng để cho đáp ứng kháng thể cao nhất mà động vật không chết. Thời gian miễn dịch là 12 tháng, mỗi tháng tiêm một lần, vào các vị trí khác nhau.
Công đoạn tách huyết tương được thực hiện như sau: rút máu từ ngựa đã gây miễn dịch, cho vào bình thủy tinh chứa ACD (Acide Citric Dextrose) chuẩn hóa vô trùng theo tỷ lệ ACD/thể tích máu nằm trong khoảng 15 đến 20%. Sau đó lắng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu tối đa ở 4°c qua đêm. Thu dịch nổi lên trên (huyết tương). Lượng dịch nổi lên trên thu được chiếm 1/2 tổng thể tích của ACD và máu. Cho phần tế bào máu còn lại vào dung dịch muối sinh lý và truyền lại vào ngựa.
Công đoạn tinh chế được thực hiện như sau: cho pepsin vào dịch huyết tương thu được theo tỷ lệ 1% thể tích, khuấy trộn đều trong 5-10 phút, hạ độ pH bằng HCl cho đến khi pH=3,2 và giữ ở 10°c trong 2 giờ. Sau đó, tăng độ pH lên tới 4,2 bằng dung dịch NaOH, khử bổ thể bằng nhiệt ở nhiệt độ 56°c bằng cách làm nóng trong bể nước nóng. Tiếp đó, hạ nhiệt độ bằng khí lạnh hoặc nước lạnh đến 10°c. Tiếp theo cho dung dịch (NH4)SO4 theo hai giai đoạn: giai đoạn 1 theo tỷ lệ 14% thể tích, khuấy đều, sau đó lọc bỏ chất kết tủa; giai đoạn 2 thêm 22% vào dịch lọc thu được ở giai đoạn 1, khuấy đều, lọc thu chất kết tủa; thẩm tích lđịchung dịch (NH4)SO4 để thu dịch và điều chỉnh hằng số sinh học của dịch thẩm tích rồi lọc vô trùng để thu được huyết thanh kháng nọc rắn.
Huyết thanh kháng nọc rắn thu được theo phương pháp nêu trên được kiểm tra chất lượng về độ an toàn, độ vô khuẩn, thử trí nhiệt tố (chất gây sốt), hiệu lực.
Huyết thanh kháng nọc rắn thu được đạt tiêu chuẩn kiểm định quốc gia, cụ thể là có các tính chất hóa, lý, dược như sau:
- Cảm quan trong suốt - Độ tinh khiết vô khuẩn, chỉ còn IgG (Fab)2 - Thành phần là kháng thể đặc hiệu kháng nguyên - Hiệu lực > 100m.u (đơn vị chuột) (mouse unit) - Thòi hạn bảo quản 5 năm ở 4°c - Các tính chất khác: trung tính
Sinh phẩm huyết thanh kháng nọc rắn có thể được bào chế ở dạng lỏng bằng cách cho huyết thanh kháng nọc rắn thu được ở trên vào với liều lượng 15ml, tiệt trùng và bảo quản ở 4°c. Sinh phẩm huyết thanh kháng nọc rắn cũng được bào chế ở dạng đông khô bằng cách làm đông khô các lọ thu được ở trên.
Ví dụ thực hiện sáng chế
Ví dụ 1: Sản xuất 3 lít huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất
Để sản xuất 3 lít huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất cần 5g nọc đông khô, một con ngựa để gây miễn dịch trong 1 năm.
Nọc rắn hổ đất đông khô thu được như sau: rắn hổ đất khỏe, các lứa tuổi, ở mọi thời tiết khác nhau được nuôi trong 1 tháng bằng chuột nhắt trắng và theo dõi sức khả. Sau đó, tiến hành lấy nọc bằng cách cắm ống mao quản (microtube) vào nanh móc độc và hút nọc ra trong vòng 3 phút. Nọc thu được được làm đông khô bằng các phương pháp làm đông khô thông thường mà chuyên gia trong lĩnh vực kỹ thuật này đã biết. Để thu được 5 g nọc đông khô cần phải có 10 con rắn hổ đất.
Để khử độc nọc rắn hổ đất tiến hành pha loãng 5g nọc khô bằng 500ml PBS, sau đó bổ sung từ từ dung dịch gluteraldehyt vào theo tỷ lệ 0,25%. Quá trình khử độc được tiến hành ở nhiệt độ 37°c, độ pH=7,3. Độ pH được điểu chỉnh bằng dung NaOH đậm đặc. Theo dõi và chỉnh độ pH trong một tuần đến khi độ pH ổn định, có nghĩa là lúc đó dung dịch đã được khử độc tố (dung dịch kháng nguyên).
Sau khi khử độc, tiến hành miễn dịch ngựa theo trình tự nêu trên trong thời gian 01 năm.
Trong quá trình miễn dịch theo dõi đáp ứng kháng thể đến cao nhất bằng 100m.u/ml thì tiến hành rút máu để thu huyết tương. Thường thì trong 1 năm rút máu 3 đến 6 lần, trong ví dụ này, tiến hành rút máu 3 lần, mỗi lần 6 lít máu. Máu thu được được cho vào bình thủy tinh chứa 1,2 lít (20%) ACD để tiến hành tách huyết tương. Sau khi lắng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu tối đa ở 4°c qua đêm. Thu dịch nổi lên trên (huyết tương). Lượng dịch nổi lên trên thu được chiếm 1/2 tổng thể tích của ACD và máu. Cho phần tế bào máu còn lại vào dung dịch muối sinh lý và truyền lại vào ngựa. Sau ba lần lặp lại công đoạn tách huyết tương thu được 9 lít huyết tương.
Công đoạn tinh chế được thực hiện như sau: cho pepsin vào 9 lít huyết tương thu được theo tỷ lệ 1% thể tích, khuấy trộn đều trong thời gian từ 5 đến 10 phút, hạ độ pH bằng HCl cho đến khi pH=3,2 và giữa ở 10°c trong 2 giờ. Sau đó, tăng độ pH lên tới 4,2 bằng dung dịch NaOH, khử bổ thể bằng nhiệt ở nhiệt độ 56°c bằng cách làm nóng trong bể nước nóng. Sau đó hạ nhiệt độ bằng khí lạnh hoặc nước lạnh đến 10°c. Tiếp theo, cho dung dịch (NH4)SO4 theo hai giai đoạn: giai đoạn 1 theo tỷ lệ 14% thể tích, khuấy đều, sau đó lọc bỏ chất kết tủa; giai đoạn 2 thêm 22% vào dịch lọc thu được ở giai đoạn 1, khuấy đều, lọc thu chất kết tủa; thẩm tích loại (NH4)SO4 để thu dịch và điều chỉnh bằng số sinh học của dịch thẩm tích rồi lọc vô trùng để thu được 3 lít huyết thanh kháng nọc rắn.
10. Nội dung có thể chuyển giao
11. Thị trường ứng dụng
12. Hình ảnh minh họa
In bài viết
Các phát minh, sáng chế khác
 
Banner
Banner home right