Trang chủ Bằng phát minh, sáng chế • Liên hệ     • Giới thiệu     • Tài liệu hướng dẫn

Phương pháp phân lập và giữ giống tảo Spirulina

Cập nhật Thứ ba - 19/01/2016 15:59 In bài viết

1. Tên sáng chế, phát minh, giải pháp:
Phương pháp phân lập và giữ giống tảo Spirulina
2. Số bằng,ký hiệu: 1-0013874
3. Thuộc lĩnh vực KH&CN Công nghệ sinh học (Sáng chế)
4. Ngày công bố 27/04/2015
5. Ngày cấp 27/04/2015
6. Chủ sở hữu chính VIỆN ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ
7. Tác giả Hoàng Thị Kim Hoa (VN), Nguyễn Văn Anh (VN)
8. Điểm nổi bật
Sáng chế đề xuất phương pháp phân lập và giữ giống tảo Spirulina từ quần thể tảo Spirulina đã bị nhiễm tảo lạ, vi khuẩn và động vật phù du để sản xuất sinh khối tảo giàu dinh dưỡng cho người và động vật. Phương pháp này dựa vào tính chuyển động hướng quang của tảo. So với phương pháp truyền thống, phương pháp này có ưu điểm là tách được tảo thuần, sạch khuẩn và động vật phù du, rút ngắn thời gian phân lập. Sau khi thu được tảo sạch, giữ tảo trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, ánh sáng yếu và nhiệt độ thấp nhằm giảm số lần cấy chuyển, đảm bảo giữ tảo chất lượng tốt.
9. Mô tả về sáng chế, phát minh, giải pháp
Lĩnh vực kỹ thuật được đề cập
Sáng chế đề cập đến lĩnh vực công nghệ sinh học, cụ thể là đề cập đến phương pháp phân lập và giữ giống tảo Spirulina để sản xuất sinh khối tảo giàu dinh dưỡng cho người và động vật
Tình trạng kỹ thuật của sáng chế
Spirulina là loài tảo lam, đa bào, dạng sợi, chiều dài sợi nằm trong khoảng 50-500μm, chiều rộng sợi nằm trong khoảng 3-8μm, phân bố rộng, tảo có thể sống được trong đất, nước ngọt, nước lợ, nước mặn và suối nước nóng. Đặc điểm nổi bật của tảo Spirulina là hàm lượng dinh dưỡng cao: protein với lượng nằm trong khoảng 60-67%, lipit với lượng nằm trong khoảng 11,5-13%, giàu sắc tố, vitamin và các chất có hoạt tính sinh học khác. Vì vậy, sinh khối tảo Spirulina và các chế phẩm từ tảo là nguồn bổ sung dinh dưỡng tốt cho người già, người bệnh và trẻ em suy dinh dưỡng. Tảo được sử dụng làm thức ăn kiêng cho người béo phì, là sản phẩm kích thích tạo sữa cho các bà mẹ nuôi con nhỏ. Tảo Spirulina và các sắc tố tách chiết từ tảo có tác dụng làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư sarcoma, tảo spirulina được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường, hỗ trợ trong điều trị chất độc hóa học, nâng cao thể trạng của bệnh nhân ung thư được điều trị bằng tia xạ. Ngoài ra, tảo Spirulina còn là nguồn thức ăn bổ sung tốt cho động vật nuôi (cá, tôm, v.v.). Do nhu cầu phục vụ y tế, dinh dưỡng và chăn nuôi, tảo Spirulina đã được nuôi trồng quy mô công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới.
Ở Việt Nam, tảo Spirulina được nghiên cứu từ sau 1970 và đã được đưa ra nuôi trồng ở qui mô công nghiệp. Để phục vụ cho việc sản xuất tảo mang lại hiệu quả kinh tế cao, vấn đề tạo và giữ giống là khâu then chốt.
Phương pháp phân lập tảo đã biết chủ yếu dựa trên phương pháp phân lập vi sinh vật thông thường: có thể tiến hành phân lập trực tiếp hoặc sau khi nuôi tích lũy mẫu phân lập bằng phương pháp pha loãng hay thu nhận khuẩn lạc riêng rẽ (gieo gạt hoặc ria trực tiếp trên mặt thạch). Tuy nhiên, nhược điểm của phương 13874 pháp này là mất nhiều thời gian, nguồn tảo thu được không sạch vi khuẩn nên chất lượng giống không cao. Bản chất kỹ thuật của sáng chế
Để khắc phục các nhược điểm nêu trên, sáng chế đề xuất phương pháp phân lập và giữ giống tảo Spirulina theo phương pháp hướng quang dựa trên đặc điểm hình dạng và khả năng hướng quang của tảo Spirulina. Hiệu quả của phương pháp này là rút ngắn thời gian phân lập, tạo giống tảo thuần, giống tảo sạch vi khuẩn từ một quần thể tảo Spirulina đã bị nhiễm tảo lạ, vi khuẩn và động vật phù du.
Spirulina hiện được xếp vào ngành vi khuẩn lam (vi sinh vật có khả năng quang hợp) nên chúng có khả năng di chuyển hướng đến vùng có ánh sáng để tiến hành quang hợp (tính hướng quang). Phương pháp phân lập và giữ giống tảo Spirulina theo sáng chế chính là dựa vào đặc tính này của tảo Spirulina. Nhờ đó, có thể sử dụng ánh sáng làm nhân tố định hướng tách tảo spirulina ra khỏi các tảo nhiễm khác cũng như động vật phù du và vi khuẩn.
Sau khi phân lập được tảo sạch, giữ tảo ở điều kiện thích hợp nhằm kéo dài thời gian cấy chuyển đồng thời giữ được tính ưu việt về năng suất và chất lượng mà dòng tảo sẵn có.
Cụ thể là, sáng chế đề xuất phương pháp phân lập và giữ giống tảo Spirulina từ quần thể tảo Spirulina đã bị nhiễm tảo lạ, vi khuẩn và động vật phù du, bao gồm các bước:
bước 1: chuẩn bị môi trường dinh dưỡng chọn lọc (môi trường Zarrouk) bao gồm: môi trường lỏng vô trùng, môi trường thạch trong đĩa petri và môi trường thạch nghiêng;
bước 2: nuôi tích lũy trong môi trường chọn lọc (môi trường lỏng Zarrouk) ở điều kiện nhiệt độ nằm trong khoảng 32-35°C, cường độ chiếu sáng nằm trong khoảng 5000-8000hix trong thời gian 1 tuần;
bước 3: phân lập tảo theo phương pháp hướng quang bao gồm: 13874 bưởc 3.1: phân lập tảo trên môi trường thạch để tách tảo thuần, loại trừ tảo lạ, vi khuẩn và động vật phù du, bước này được tiến hành như sau:
lọc giống tảo từ quần thể thu được ở bước 2 bằng vải lọc; bôi dịch lọc thu được thành một vệt đậm có đường kính nằm trong khoảng 0,6-0,8cm ở chính giữa đĩa thạch;
đậy nắp và bọc kín bằng giấy sạch vô trùng;
cắt 1 lỗ có đường kính nằm trong khoảng l,5-2cm ở phía mặt giấy ở đáy đối diện với vết tảo;
giữ các đĩa trong bóng tối trong thời gian 1 ngày đêm ở nhiệt độ nằm trong khoảng 25-28 °C;
sau đó, đưa ra dàn đèn có nhiệt độ nằm trong khoảng 28-30oC, cường độ chiếu sáng nằm trong khoảng 5000-80001ux trong khoảng thời gian 5-7 ngày; và bước 3.2: tách và nhân nuôi tảo thuần, bước này được tiến hành như sau: dùng dao đã vô trùng cắt khoanh một vòng quanh đĩa thạch; úp đĩa để thạch rơi vào tờ giấy đã vô trùng;
cắt một lớp thạch mỏng phía trên có chứa các tế bào tảo Spirulina sạch và thả vào bình tam giác 100ml chứa môi trường lỏng đã được chuẩn bị ở bước 1;
để các bình này trong bóng tối qua đêm ở nhiệt độ nằm trong khoảng 25-30°C;
sau đó, đưa các bình này ra dàn đèn có nhiệt độ nằm trong khoảng 25- 28°C, cường độ chiếu sáng nằm trong khoảng 1000-20001ux;
khi tảo mọc xanh, kiểm tra lại độ sạch của tảo bằng kính hiển vi để xác định đúng giống tảo mong muốn; và bước 4: giữ giống tảo trên môi trường thạch nghiêng ở nhiệt độ nằm trong khoảng 4-5,5oC, cường độ chiếu sáng thấp nằm trong khoảng 400-600lux, nghèo dinh dưỡng bicarbonat.
Theo một phương án bổ sung, bước 1 được tiến hành trong buồng cấy vô trùng và chiều dày lớp thạch trong đĩa petri nằm trong khoảng 0,5-0,6cm. 13874
Mô tả chi tiết sáng chế
Để đạt được mục đích nêu trên, phương pháp theo sáng chế bao gồm các bước sau:
1) Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng chọn lọc (MT Zarrouk): tuy từng giai đoạn của quy trình sử dụng môi trường thạch đặc hoặc môi trường lỏng với lượng thạch khác nhau, bao gồm: môi trường Zarrouk (lỏng), môi trường thạch đĩa petri, môi trường thạch nghiêng (ống nghiệm).
* Môi trường Zarrouk: 13874

NiSO4.7H2O 478,5.10-4
Na2WO4 179,4.10-4
Ti2(SO4)3 400. l0-4
Co(NO3)2.6H2O 439.10-4 Độ pH 8-10
1.1 Chuẩn bị môi trường lỏng vô trùng:
Dung dịch 1: Hoà tan 16,8g NaHCO3 trong 1000ml nước cất;
Dung dịch 2: Hoà tan 2,5g NaNO3; lg K2SO4; lg NaCl; 0,2g MgSO4.7H2O; 0,04g CaCl2 trong 100ml nước cất;
Dung dịch 3: Hoà tan 0,5g FeSO4.7H2O và 4,0g EDTA trong 500ml nước cất, sau đó đun sôi cho tan hết;
Dung dịch 4: Hoà tan 25kg K2HPO4 trong 500ml nước cất;
Dung dịch 5: Dung dịch gồm các nguyên tố vi lượng (thành phần đã biết ở trên);
Chuẩn bị 5 loại dung dịch trên được khử trùng ở áp suất lat trong 30 phút, sau đó làm nguội;
Trộn dung dịch 1 và dung dịch 2, sau đó thêm 10ml dung dịch 3, 10ml dung dịch 4,1 ml dung dịch A5, 1 ml dung dịch B6. Các thao tác này đều tiến hành trong tủ cây vô trùng.
1.2 Chuẩn bị môi trường thạch trong đĩa petri:
Thêm 2,5g thạch vào 250ml môi trường Zarrouk, đun sôi trên bếp cho tan hết thạch, sau đó rót vào bình tam giác chịu nhiệt 500ml, nút bông, khử trùng ở 0,5at trong 30 phút. Rót môi trường còn nóng vào các đĩa petri đã vô trùng, sao cho chiều dày lớp thạch trên đĩa petri nằm trong khoảng 0,5-0,6cm. Các thao tác tiến hành trong buồng cấy vô trùng. Để môi trường nguội đến nhiệt độ phòng thí nghiệm, đậy nắp đĩa petri lại và tiến hành các bước tiếp theo.
1.3 Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm: 13874
Thêm 4,5g/l bicarbonat vào môi trường Zarrouk, sau đó thêm 35g/l NaCl vào dung dịch này. Thêm 2g thạch vào 100ml hỗn hợp này, sau đó, đun trên bếp điện kèm khuấy đến khi thạch tan hết. Sau khi thạch tan hết, rót thạch nóng vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa khoảng 7ml dung dịch, đậy nút bông, đặt các ống nghiệm trên khay nghiêng một góc khoảng 30° sao cho thạch trong ống nghiệm giàn nghiêng theo chiều dài ống nghiệm và chú ý không để thạch dính lên miệng ống nghiệm. Sau đó vài ngày, loại bỏ những ống nghiệm bị nhiễm được giữ ở nhiệt độ trong phòng nằm trong khoảng 28-30oC.
2) Nuôi tích lũy trong môi trường chọn lọc (MT lỏng Zarrouk):
Nuôi giống tảo Spirulina bị nhiễm nặng các tảo khác cũng như động vật phù du và vi khuẩn trong môi trường Zarrouk ở nhiệt độ nằm trong khoảng 32- 350C, cường độ chiếu sáng nằm trong khoảng 5000-80001ux trong bình tam giác 100ml trong khoảng 1 tuần — việc nuôi Spirulina trong môi trường chọn lọc (MT Zarrouk có độ pH mang tính kiềm cao nằm trong khoảng 8-10 thích hợp cho sự phát triển của Spirulina) nhằm mục đích giúp quần thể Spirulina có cơ hội phát triển tốt, lấn át sự phát triển của các loài tảo khác (tảo lục, tảo nâu) cũng như các động vật phù du và vi sinh vật có mặt trong mẫu.
3) Phân lập tảo theo phương pháp hướng quang:
3.1. Phân lập
Giống tảo thu được sau khi nuôi tích lũy được lọc qua vải lọc thu sinh khối - kỹ thuật này được tiến hành dựa trên đặc điểm hình thái của Spiralina là dạng sợi xoắn không phân nhánh, chiều dài có thể đạt tới l/4mm hoặc hơn nên có thể dễ dàng lọc tảo bằng các loại vải để thu hoạch tảo spirulia, đồng thời loại bớt các tảo đơn đơn bào, động vật phù du và vi sinh vật khác bị nhiễm trong mẫu. Dùng que cấy bôi một vệt đậm (tảo sau khi làm đặc) có đường kính nằm trong khoảng 0,6-0,8cm ở chính giữa đĩa thạch. Tiến hành bôi 4-5 đĩa (số lượng đĩa petri cần bôi phụ thuộc vào nhu cầu lượng giống cần phân lập). Sau đó, đậy nắp đĩa petri, bọc kín đĩa bằng giấy màu đen sạch vô trùng. Phía mặt giấy ở đáy đĩa đối diện với vết tảo được cắt 1 lỗ có đường kính nằm trong khoảng l,5-2cm. Các đĩa được giữ 13874 trong bóng tối trong thời gian 1 ngày đêm ở nhiệt độ 25-28°C. Sau đó, đưa ra dàn đèn có nhiệt độ nằm trong khoảng 28°C-30°C, cường độ chiếu sáng nằm trong khoảng 5000-8000lux. Các đĩa để lật úp, phần giống tảo (có lỗ thủng) được hướng lên đèn. Do có đặc tính hướng quang và sinh trưởng với cấu trúc dạng sợi, tảo Spirulina sẽ mọc xuyên qua lớp thạch, để lại phía dưới các loại tảo lục, tảo nâu, các động vật phù du và vi sinh vật. Tiến hành quan sát hàng ngày mặt đáy đĩa thạch, sau khoảng 5-7 ngày cho đến khi thấy tảo mọc một vệt xanh mờ ở đáy của đĩa.
3.2 Tách và nhân nuôi tảo thuần:
Cấy tách tảo từ đĩa petri nhân nuôi trong môi trường lỏng vô trung: Rót môi trường đã vô trùng vào bình tam giác l00ml đã vô trùng, dùng dao cắt đã được vô trùng trên ngọn lửa đèn côn, tách thạch cho long ra khỏi đĩa petri bằng cách khoanh một đường theo chu vi đĩa petri. Sau đó, úp đĩa để thạch rơi vào một tờ giấy đã được vô trùng. Dùng dao cắt một lớp thạch mỏng, ở phía trên lớp thạch này chứa các tế bào tảo Spirulina sạch. Sau đó, thả các lớp thạch chứa các tế bào tảo Spirulina sạch này vào trong các bình tam giác 100ml có chứa môi trường nuôi cấy lỏng. Để các bình giống này trong bóng tối qua đêm ở nhiệt độ nằm trong khoảng 25-300C, sau đó đưa các bình này ra dàn đèn có nhiệt độ nằm trong khoảng 25°C-28°C, cường độ chiếu sáng nằm trong khoảng 1000-20001ux.
Khi thấy tảo mọc xanh trong các bình, tiến hành kiểm tra lại độ sạch của tảo bằng kính hiển vi để xác định đúng giống tảo mong muốn.
4) Giữ giống:
Cây giống tảo sạch đã được phân lập ở trên vào các ống thạch nghiêng. Sau khi tảo mọc xanh, chuyển các ống nghiệm này vào trong điều kiện nhiệt độ nằm trong khoảng 4-5,5oC, cường độ chiếu sáng yếu nằm trong khoảng 400-600lux, nghèo dinh dưỡng bicarbonat để giữ giống. 13874
Ví dụ thực hiện sáng chế
Ví dụ sau đây nhằm minh hoạ sáng chế mà không giới hạn sáng chế. Phương pháp phân lập và giữ giống tảo Spirulina theo sáng chế bao gồm:
Bước 1: Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng (MT lỏng, MT đặc Zarrouk)
Bước 2: Nuôi tích lũy trong môi trường chọn lọc
Rót môi trường Zarrouk vào các bình tam giác 100ml, đậy nút bông và mũ giấy. Khử trùng các bình tam giác này ở áp suất 1at, nhiệt độ 1200C trong 30 phút. Sau đó, làm nguội môi trường này đến nhiệt độ trong phòng và giữ môi trường này trong vài ngày để kiểm tra xem môi trường có bị lắng hoặc bị nhiễm các vi sinh vật, nấm, v.v. không, nếu môi trường bị kết tủa hoặc bị nhiễm các vi sinh vật, nấm, v.v. thì phải chuẩn bị lại.
Cây tảo vào môi trường được chứa trong bình tam giác, để trong bóng tối qua đêm ở nhiệt độ nằm trong khoảng 28-30°C. Sau đó, đặt tảo ở dàn đèn có nhiệt độ nằm trong khoảng 32°C-35°C, cường độ chiếu sáng nằm trong khoảng 5000- 8000lux để tảo phát triển trong khoảng 1 tuần.
Bước 3: Phân lập tảo theo phương pháp hướng quang
3.1 Phân lập: Lọc bình tảo đã được làm nuôi tích lũy theo Bước 2 qua vải lọc để thu sinh khối. Lấy sinh khối tảo vừa lọc bằng que và bôi một vệt đậm giữa đĩa thạch (đĩa petri nêu trên) có đường kính nằm trong khoảng 0,6-0,8cm. Sau đó, đậy nắp, bọc kín đĩa bằng giấy màu đen sạch vô trùng. Phía mặt giấy ở đáy đĩa đối diện với vết tảo được cắt 1 lỗ có đường kính nằm trong khoảng l,5-2cm. Các đĩa được giữ trong bóng tối trong thời gian 1 ngày đêm ở nhiệt độ nằm trong khoảng 25-28°C. Sau đó, đưa ra dàn đèn có nhiệt độ nằm trong khoảng 28°C-30°C, cường độ chiếu sáng nằm trong khoảng 5000-80001ux trong thời gian 5-7 ngày. Các đĩa để lật úp, phần giống tảo (có lỗ thủng) được hướng lên đèn. Do đặc tính hướng quang mạnh, tảo Spirulina sẽ mọc xuyên qua lớp thạch, để lại phía dưới các loại tảo lục, tảo nâu, các động vật phù du và vi sinh vật.
10. Nội dung có thể chuyển giao
11. Thị trường ứng dụng
12. Hình ảnh minh họa
In bài viết
Các phát minh, sáng chế khác
 
Banner
Banner home right